Magcapture マイクロrnaアイソレーションキット ヒトago2 マニュアル

Magcapture ヒトago マイクロrnaアイソレーションキット

Add: idetide10 - Date: 2020-11-17 09:47:28 - Views: 5168 - Clicks: 5911

MagCapture™ マイクロRNAアイソレーションキット, ヒトAgo2 遺伝子研究用: MagCapture™ マイクロRNAアイソレーションキット, マウスAgo2 遺伝子研究用: MagCapture™ マイクロRNAアイソレーションキット, Ago1-4 遺伝子研究用. 吉岡先生:研究技術の中には、研究の動向に応じてその需要が著しく変化するものがあります。例えば、核酸配列解析のニーズの高まりに伴い、1980年代に登場した自動シークエンサーの性能は飛躍的に上昇し、現在では次世代シークエンサーも登場しています。一方、超遠心機はかつて頻繁に使用されていたにも関わらず、徐々に使用頻度が下がってきた装置の1つに挙げられます。 ところが、ISEVでも推奨されているように、超遠心機はエクソソームの調製法として最も信頼度の高い手法であるため、エクソソームの研究が盛んになると、以前より頻繁に使用されるようになってきました。 当研究室では乳がん細胞から分泌される直径30~200 nmのエクソソームを主に研究対象としていますが、サイズが300 nmもの細胞外小胞が細胞から分泌される場合もあり、これらのサイズが異なる粒子の性質が同一か否かは現在のところ明確ではありません。超遠心法の技術やエクソソームの分離方法がさらに改善されれば、例えばエクソソームのサイズの相違による機能的な違いといった部分も明らかになるのではないかと期待しています。 また、ある種のがん細胞が分泌するエクソソームなどのように、特定のエクソソームのみを精製するといった、さらに高い精度が要される技術へのニーズも高まることが予測されます。その際には、既存の技術に改良を加えたり、例えばエクソソームソーティングのためのフローサイトメトリーなどの技術と組み合わせたりすることで、現段階では理解が困難な生命現象のしくみに関しても、解明の糸口が見つかる日が来るのではないかと考えています。. 吉岡先生:エクソソームの細胞への取り込みを解析する際には、エクソソームに蛍光色素を添加して標識し、その挙動を追跡する方法があります(図7)。しかし、この方法では、蛍光標識する際に、手間と時間をかけて回収したエクソソームの大半をロスすることと、取り込まれたエクソソームの細胞内機能の評価は困難であることを課題と考えています。 図7:蛍光標識したエクソソームの取り込み観察。回収したエクソソームを蛍光標識し、細胞培養液中に添加した。赤色矢印で示される緑色は標識されたエクソソーム、青色は核を示す(吉岡先生ご提供) そのため、細胞内に取り込まれたエクソソームの機能的な評価法として、当研究室では、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子発現への影響を計測する細胞系を構築しています19)(図8)。その1つでは、ルシフェラーゼの発現を抑制するsiRNAを内包したエクソソームを、ルシフェラーゼレポーター発現系を有する細胞に添加して、ルシフェラーゼ活性の有無を評価しています。この評価系においては、ルシフェラーゼレポーター発現細胞およびルシフェラーゼ遺伝子に対するsiRNAの産生細胞を作製する必要がありますが、一旦細胞株を構築すれば、細胞からエクソソームを回収する操作は通常のエクソソーム回収と同様に行えます。 エクソソームの細胞内への取り込み様式に関しては、現在未知の部分が多くあり、今後生体内での取り込みメカニズムの解析も含めて、多くの研究からの新たな知見が期待されています。 図8:エクソソームに含まれるmiRNA取り込み評価の模式図(吉岡先生ご提供)。 (a)評価するmiRNAの相補鎖をルシフェラーゼ遺伝子下流に組み込んだプラスミドを作製し、受容細胞のゲノム中に組み込む (b)エクソソームを受容細胞に添加し、一定時間培養後にルシフェラーゼ活性を測定する。 (c)細胞内にエクソソームが取り込まれ、内包されたmiRNAが標的に作用する場合。 miRNAが相補鎖に結合してルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制されるため、ルシフェラーゼ活性は低下する。. PureExo® エクソソーム単離キット | PureExo® エクソソーム(エキソソーム)単離キットは、細胞培養上清(品番:P100)血清/血漿(品番:P101)または幹細胞培養上清(品番:P107)から完全なエクソソームを、迅速かつ効果的に回収することができます。.

タンパク質 生化学的な実験においても、エクソソームの性質や作用を解析する際には、タンパク質濃度と粒子数をエクソソームの量を示すための指標として用います。ただし、この2つの値は、エクソソームの絶対量を表すものではありません。現在のところ、すべてのエクソソームに発現し、放出元の細胞種やその状態・条件にかかわらず、発現量が一定に保たれる基準物質※6は見つかっていませんが、多くのエクソソームに存在が認められているテトラスパニンタンパク質※7のCD9、CD63およびCD81、エンドソーム輸送選別複合体因子(ESCRT:Alix,TSG101)、heat shock proteins(Hsp60, Hsp70, Hsp90)などが便宜的にマーカー分子として位置付けられています。そのため、エクソソームに関する研究論文では、これらのマーカー分子のうち数個を同条件で解析して提示することが慣例となっています。例えば、比較実験で、タンパク質loading量を揃えて行ったWBの結果を示した場合、マーカータンパク質の発現量に対して他のタンパク質の相対的な発現量を評価することが可能になります。エクソソームの絶対量を正確に示してくれる基準物質の解明・選定は、今後エクソソームの臨床への応用の際、その投与量を設定する上で特に必要となります。 miRNA 診断目的で使うエクソソームのインターナルコントロールについては、解析回数を重ねて発現量があまり変動しないと確認した特定のmiRNAsを、エクソソームの量を表すための基準物質として位置付けることが考えられます。最近よく目にするのは、アレイ手法などで相当の数、何百検体を解析してその中で発現量のばらつきが少ないmiRNAなどを特定して、インターナルコントロールの候補として選出することです。つまり、自分たちの実験プラットフォームで特定のmiRNAsが変動しないことを証明して論文などに示して、それらmiRNAsを例えばリキッドバイオプシーの指標として使用することもできます。. 吉岡先生:エクソソームの回収後に、エクソソームの膜マーカータンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法によって、エクソソームを濃縮することがあります。その後、Western Blottingにより目的の内包タンパク質の検出を行ったり、濃縮したエクソソームを用いた細胞添加などの実験を行ったりすることがあります。しかし、エクソソームの濃縮過程で用いた抗体を遊離させた「フリー」のエクソソームを得たい場合に、抗体遊離が困難な点、さらに抗体遊離の処理条件が厳しすぎる場合にエクソソームが崩壊してしまう点を課題と感じています。免疫沈降法のデメリットとしては、特定の膜マーカータンパク質を持つエクソソームのみが濃縮されるため、必要量のエクソソームを得るためには、エクソソーム回収に用いる初期細胞数がかなり必要な点が挙げられます。 マイクロrnaアイソレーションキット エクソソーム中のmiRNAなどの核酸やタンパク質といった内包物質の解析のためには、回収したエクソソームを溶解して内包物質を抽出しています。miRNAを解析する際にはRNA溶出用の試薬を用い、タンパク質を解析する際には、界面活性剤を用いてエクソソーム粒子を溶解させ、抽出したタンパク質を質量分析などに用いています。. 吉岡先生:当研究室では、回収後のエクソソーム溶液中に存在する粒子数や粒子サイズを測定するために、動的光散乱法を用いています。動的光散乱法では、回収後の溶液にレーザー光を照射し、粒子による光散乱によって粒子サイズを算出でき18)、さらにCCDカメラによる画像解析も可能なので、見かけ上の粒子濃度を算出することができる、といったメリットがあります(図5)。 図5:動的光散乱による粒子径の計測。超遠心法にて回収したエクソソームを含む分画の粒子径分布を動的光散乱により確認した。縦軸は粒子数、横軸は粒子径を 表す。100~200 nmの粒子が多く含まれる(吉岡先生ご提供) magcapture マイクロrnaアイソレーションキット ヒトago2 マニュアル 動的光散乱法のメリットは、溶液中のおおよその粒子濃度と粒子サイズの分布を手軽に測定できるため、エクソソームの回収・調製操作の成功可否の判断を容易に行えることが挙げられます。一方、デメリットとしては、エクソソームのみが特異的に計測されるわけではないため、溶液中の微粒子やエクソソームと同程度のサイズのタンパク質凝集体などの夾雑物も同時に検出されてしまうことが挙げられます。したがって、夾雑物が多く混在している試料においては、正確にエクソソームの濃度、粒子サイズを反映した測定値を得られない点に注意が必要です。 その他のエクソソーム確認法としては、電子顕微鏡による脂質二重膜粒子の画像確認も行われています(図6)。ISEVでは電子顕微鏡によるエクソソーム粒子の確認は必須ではありませんが、論文審査の際には必要な場合があります。電子顕微鏡による観察では、エクソソーム粒子の存在と粒子サイズの確認は可能ですが、溶液中に存在するエクソソーム粒子数に関しての情報は得られませんし、どの施設でも使用できるわけではありません。そのため、動的光散乱法による情報を補足しながら解析を進める場合も多くあります。 図6:位相差電子顕微鏡によるエクソソームの形態観察。脂肪由来間葉系幹細胞が分泌したエクソソームを超遠心法にて回収後、位相差電子顕微鏡で観察したスケールバー:100 nm(吉岡先生ご提供) マニュアル 回収溶液中のエクソソーム量を確認する際には、エクソソーム量と相関がみられる溶液中のタンパク質濃度を目安として用い、回収されたエクソソーム量を算出しています。したがって、エクソソームの純度は、①回収溶液中での目的のサイズ範囲内(およそ30 nm~20. See full list magcapture on beckman.

エクソソームのin vitro投与実験:培養細胞 エクソソームの機能を調べるために、よく培養細胞を用いた投与実験が行われますが、その際に問題になるのはエクソソーム対細胞数の量比を決めることです。上記にもありましたように、エクソソームの絶対量を示す基準物質の同定はなされていないため、タンパク質濃度、粒子数やマーカー分子を指標として用います。もう1つ問題視されるのは、実験で用いたエクソソーム量が、生理的に妥当であるかどうかという点です。これは、ほとんど未解明なことで、in vitroの投与実験では、エクソソームの情報(例えば、どれくらいの培養細胞数を何時間培養した後の上清から由来しているなどの基本情報)および標的細胞の情報(培地の容量、細胞数、処理時間や条件)を提供するようにしています。 エクソソームのin vivo投与実験:動物 エクソソームを動物に投与してその影響を調べる実験では、エクソソームを回収した細胞数から投与量の生理的妥当性をある程度判断することが可能です。例えば、がん細胞107個分の48時間培養上清からエクソソームを回収し、体重20 magcapture マイクロrnaアイソレーションキット ヒトago2 マニュアル gのマウス1匹に投与した場合、がん細胞107個を腫瘍の塊に換算すると、ほんの小さな塊と想像でき、細胞として注射するにも問題ない量に相当するといえるでしょう(細胞107個の遠心後のペレットサイズから予想)。この場合、生理的条件としてあり得る投与量と判断できます。もし、投与するエクソソームの量が例えば5 g分の腫瘍に相当するならば、それはマウス1匹に注射しきれないほど多いと考えられます。このような観点からプロトコールを立てることで、生体内で起こり得る現象をみているのかどうかが判断できますし、その視点を持つことが重要です(ただし、生体内の細胞はエクソソームを常に放出しているので一過的に投与した場合とは異なる条件であることを考慮しておくことも必要です)。 ゼータ電位 もう1つ、エクソソームの機能に影響すると考えられているのはゼータ電位です。エクソソームのゼータ電位は、明らかに放出元の細胞によって違います。それは主に膜タンパク質の糖鎖含量や種類によって変動するとされています。糖鎖組成は、がん細胞の細胞膜表面で、がん化に伴って変化することが報告されており、エクソソームの表面においても、それが反映されるといわれています。 ⇐前へ 次へ⇒. 「MagCapture™ マイクロRNAアイソレーションキット, ヒトAgo2」。富士フイルム和光純薬株式会社は、試験研究用試薬・抗体の製造販売および各種受託サービスを行っています。先端技術の研究から、ライフサイエンス関連、有機合成用や環境測定用試薬まで、幅広い分野で多種多様なニーズに応え. 「マイクロRNAアイソレーションキット, マウスAgo2」。富士フイルム和光純薬株式会社は、試験研究用試薬・抗体の製造販売および各種受託サービスを行っています。先端技術の研究から、ライフサイエンス関連、有機合成用や環境測定用試薬まで、幅広い分野で多種多様なニーズに応えています。. ; 285:⇐前へ 次へ⇒.

内包タンパク質、miRNAなどの解析や、細胞内へのエクソソーム取り込みの解析により、エクソソームの生理学的機能や生物学的意義が明らかにされていくと考えられる。そういった過程でのエクソソーム回収・調製および解析のためのツールとして、超遠心機を含む機器においての改良や組み合わせなどによる貢献も不可欠と考える。 参考文献 18)入江文子、粉体技術、 年;5 巻2 号:pp124-7、一般社団法人 日本粉体工業技術協会 19)Kosaka N, et al. 吉岡先生:得られたエクソソームを目的の解析に用いる前に、タンパク質量(濃度)と粒子数を把握することで解析が行いやすくなります(情報として量を知ることは重要です)。タンパク質量の測定には、一般的な方法を用いることも可能ですが、エクソソーム溶液のタンパク質濃度は低いことが多いので、低濃度でも測定が可能なマイクロBCA法などの使用が推奨されます。 一方、粒子数の測定には、その手軽さおよび少量の試料で測定が可能なことから、動的光散乱装置を用いることが増えてきました。この装置は溶液中に存在するエクソソーム以外の微粒子も区別せずに検出しますが、溶液中の粒子径も同時に測定します。回収されたEVsの大半が100 nmを中心とした分布を示していれば、エクソソームのサイズに該当していることが確認できます。 タンパク質濃度と粒子数は現在、例えば、エクソソームをin vitroで細胞に添加する実験やin vivoでマウス尾静脈に投与する実験の場合などで、エクソソーム量の指標として用いられています。これまでの経験より、培養細胞株が異なっても、細胞株ごとに回収されるエクソソーム標品の粒子数はタンパク質濃度と直線的相関を示すので、エクソソームの量を評価する上で粒子数の情報は有用です。. 「MagCapture™ マイクロRNAアイソレーションキット, Ago1-4」。富士フイルム和光純薬株式会社は、試験研究用試薬・抗体の製造販売および各種受託サービスを行っています。先端技術の研究から、ライフサイエンス関連、有機合成用や環境測定用試薬まで、幅広い分野で多種多様なニーズに応えて. 製品名MagCapture(TM) magcapture マイクロrnaアイソレーションキット ヒトago2 マニュアル マイクロRNAアイソレーションキット, ヒトAgo2 製品コードCAS ヒトago2 No N/A製造者富士フイルム和光純薬株式会社 大阪市中央区道修町三丁目1番2号 Tel:Fax:供給者富士フイルム和光純薬株式会社.

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